Nature：体内造血干细胞基因治疗的新策略，高表达CD47慢病毒+新生儿窗口期

5月28日，发表在《Nature》期刊上的一篇标题为 In vivo haemopoietic stem cell gene therapy enabled by postnatal trafficking 的研究，

通过在新生小鼠体内直接输注慢病毒载体LV来实现造血干细胞HSPC体内基因治疗的可行性。

这项研究的核心发现是，在生命早期，特别是新生儿小鼠时期，循环中的造血干细胞数量显著高于成年小鼠，并且它们正从其他造血部位（如肝脏和脾脏）大量迁移到骨髓。通过流式分析对不同年龄小鼠（新生儿、1周、2周和8周大）骨髓、外周血、脾脏和肝脏中的造血细胞群体发现，在外周血中，HSPCs 的绝对数量在新生儿时期最高，随后急剧下降，在两周龄和八周龄时维持在低水平。在骨髓、脾脏和肝脏中也观察到随年龄增长的 HSPC 动态变化。对人类样本的分析也发现，新生儿外周血中的 cHSPCs 比例远高于成年人 (>18岁)，提供了一个进行体内基因递送的独特机会。

基于这一观察，将慢病毒载体LV，直接注射到新生小鼠体内，通过追踪小鼠血液中带有标记细胞（绿色荧光蛋白 GFP）的细胞比例，来衡量基因是否成功送达。结果发现，在新生儿时期注射基因载体的小鼠，血液里带有标记的细胞数量明显比年纪大的小鼠高得多。即使给年纪较大的小鼠用了促进造血干细胞跑到血液里的药（动员处理），新生儿的基因送达效率仍然是它们的近两倍。这说明，不光是细胞数量多，新生儿时期细胞本身可能也更容易接收基因。

为了让这个慢病毒更不容易被吞噬细胞清理掉，开发了一个工程化病毒载体表面带上高含量的 CD47 蛋白 ( CD47high-LV)。在免疫缺陷小鼠NSG小鼠模型中，使用CD47high-LV慢病毒载体，在新生儿时期给药后，细胞标记水平提高了四倍，显著高于用不带 CD47 的载体或给成年小鼠给药的效果。这证明了这种高表达CD47的慢病毒确实能提高基因载体成功进入造血干细胞的效率。新生儿和两周大的小鼠即使接受了高剂量的基因载体，也没有出现毒性反应，而成年小鼠在高剂量下则出现了毒性。

为了评估这种方法的转化潜力，研究人员在多种疾病小鼠模型中进行了测试，包括腺苷脱氨酶缺乏症 (ADA-SCID)、范科尼贫血。

在 ADA-SCID （腺苷脱氨酶缺乏症）模型中，这是一种基因缺陷导致的严重免疫缺陷病。由于身体不能正常代谢一种物质，导致有毒产物堆积，损害免疫细胞。使用了三种不同设计、能表达 ADA 酶的基因载体。将这些基因载体注射到患病新生小鼠体内后，与未经治疗全部在断奶前死亡的对照组相比，接受基因治疗的小鼠存活时间显著延长，并且能像健康小鼠一样正常生长。治疗后，小鼠血液中修好的细胞数量持续增加，免疫系统重建速度也最快。

进一步的实验是将这些治疗过的新生小鼠的骨髓细胞移植到其他免疫缺陷小鼠体内，结果只有接受 PGK.ADA-LV 治疗过的小鼠的骨髓细胞，才能让受体小鼠长期存活，证明修好的干细胞具有强大的重建功能，就像健康小鼠的细胞一样。

在范科尼贫血模型中，这是一种基因缺陷导致的DNA修复障碍，最终会导致骨髓衰竭，患病新生小鼠的循环造血干细胞数量本身就非常少 。研究人员将携带 FANCA 基因的慢病毒载体 (PGK.FANCA-LV) 注射到患病新生小鼠体内。随着时间推移，小鼠血液中带有校正基因的细胞数量持续增加，这表明，带有校正基因的范科尼贫血细胞比没有校正基因的细胞更强壮，在体内具有明显的生长优势。

同时，小鼠的血常规指标（如白细胞、淋巴细胞）也逐渐恢复正常，说明修好的干细胞经过扩增，最终足以恢复血液功能。为了更好地模拟范科尼贫血患者可能出现的骨髓衰竭，研究人员使用了丝裂霉素C对患病细胞有毒性的药物进行攻击。结果显示，接受基因治疗并暴露于 MMC 的小鼠，带有校正基因的细胞发生了显著扩增，血液功能迅速恢复。而未经治疗的患病小鼠在丝裂霉素C攻击后则出现了严重的造血功能下降，模拟了疾病恶化。这些都再次证明了基因校正的细胞在受到压力时能够显现出优势并扩增。 

总结来说，这项研究利用新生儿生命早期独特的生理状态，特别是造血干细胞大量迁移到骨髓的黄金窗口期，通过直接在体内注射经过优化的慢病毒基因载体，可以实现高效、长期且相对安全的基因转移到造血干细胞中。这种方法避免了传统基因疗法所需的复杂体外操作和对患者有害的预处理。在 ADA-SCID 和范科尼贫血等多种疾病模型中取得的成功，特别是校正细胞表现出的明显优势和重建能力，这项技术有潜力成为治疗多种遗传性血液病的新一代疗法，为这些疾病的患儿带来更早、更有效的治疗希望。

顺便提一下，这种CD47高表达的LV制备原理是：慢病毒载体在出芽离开生产细胞时，会从细胞膜上包裹一层脂质双层膜，并整合膜蛋白。通过在表达CD47的细胞（很可能就是常规用于生产LV的293T细胞，或者经过工程改造以高表达CD47的细胞）中生产慢病毒，可以使LV表面包裹上来自这些细胞的CD47蛋白。

参考文献：Milani, M., Fabiano, A., Perez-Rodriguez, M. et al. In vivo haemopoietic stem cell gene therapy enabled by postnatal trafficking. Nature (2025).